Что означает выражение "активность фермента"? Измерение ферментативной активности.

(активаторы - повышают, ингибиторы - понижают) Белковые ферменты синтезируются на рибосомах , а РНК - в ядре.

Термины «фермент» и «энзим» давно используют как синонимы (первый в основном в русской и немецкой научной литературе, второй - в англо- и франкоязычной).
Наука о ферментах называется энзимологией , а не ферментологией (чтобы не смешивать корни слов латинского и греческого языков).

История изучения

Термин фермент предложен в XVII веке химиком ван Гельмонтом при обсуждении механизмов пищеварения .

В кон. ХVIII - нач. XIX вв. уже было известно, что мясо переваривается желудочным соком , а крахмал превращается в сахар под действием слюны. Однако механизм этих явлений был неизвестен

Ферменты широко используются в народном хозяйстве - пищевой, текстильной промышленности, в фармакологии.

Классификация ферментов

По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на 6 классов согласно иерархической классификации ферментов (КФ , - Enzyme Comission code). Классификация была предложена Международным союзом биохимии и молекулярной биологии (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Каждый класс содержит подклассы, так что фермент описывается совокупностью четырёх чисел, разделённых точками. Например, пепсин имеет название ЕС 3.4.23.1. Первое число грубо описывает механизм реакции, катализируемой ферментом:

КФ 1: Оксидоредуктазы , катализирующие окисление или восстановление. Пример: каталаза , алкогольдегидрогеназа
КФ 2: Трансферазы , катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы , переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ .
КФ 3: Гидролазы , катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы , пепсин , трипсин , амилаза , липопротеинлипаза
КФ 4: Лиазы , катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов.
КФ 5: Изомеразы , катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата.
КФ 6: Лигазы , катализирующие образование химических связей между субстратами за счет гидролиза АТФ . Пример: ДНК-полимераза

Кинетические исследования

Кривая насыщения химической реакции, иллюстрирующая соотношение между концентрацией субстрата [S] и скоростью реакции v

Простейшим описанием кинетики односубстратных ферментативных реакций является уравнение Михаэлиса - Ментен (см. рис.). На сегодняшний момент описано несколько механизмов действия ферментов. Например, действие многих ферментов описывается схемой механизма «пинг-понг».

Структура и механизм действия ферментов

Активность ферментов определяется их трёхмерной структурой .

Как и все белки, ферменты синтезируются в виде линейной цепочки аминокислот , которая сворачивается определённым образом. Каждая последовательность аминокислот сворачивается особым образом, и получающаяся молекула (белковая глобула) обладает уникальными свойствами. Несколько белковых цепей могут объединяться в белковый комплекс. Третичная структура белков разрушается при нагревании или воздействии некоторых химических веществ.

Чтобы катализировать реакцию, фермент должен связаться с одним или несколькими субстратами. Белковая цепь фермента сворачивается таким образом, что на поверхности глобулы образуется щель, или впадина, где связываются субстраты. Эта область называется сайтом связывания субстрата. Обычно он совпадает с активным центром фермента или находится вблизи него. Некоторые ферменты содержат также сайты связывания кофакторов или ионов металлов.

У некоторых ферментов есть сайты связывания малых молекул, они могут быть субстратами или продуктами метаболического пути, в который входит фермент. Они уменьшают или увеличивают активность фермента, что создает возможность для обратной связи.

Для активных центров некоторых ферментов характерно явление кооперативности .

Специфичность

Ферменты обычно проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам. Это достигается частичной комплементарностью формы, распределения зарядов и гидрофобных областей на молекуле субстрата и в центре связывания субстрата на ферменте. Ферменты демонстрируют высокий уровень стереоспецифичности, региоселективности и хемоселективности.

Модель «ключ-замок»

Гипотеза Кошланда об индуцированом соответствии

Более реалистичная ситуация в случае индуцированного соответствия. Неправильные субстраты - слишком большие или слишком маленькие - не подходят к активному центру

В 1890 г. Эмиль Фишер предположил, что специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата . Такое предположение называется моделью «ключ-замок». Фермент соединяется с субстратом с образованием короткоживущего фермент-субстратного комплекса. Однако, хотя эта модель объясняет высокую специфичность ферментов, она не объясняет явления стабилизации переходного состояния, которое наблюдается на практике.

Модель индуцированного соответствия

В 1958 г. Дениел Кошланд предложил модификацию модели «ключ-замок» . Ферменты, в основном, - не жесткие, а гибкие молекулы. Активный центр фермента может изменить конформацию после связывания субстата. Боковые группы аминокислот активного центра принимают такое положение, которое позволяет ферменту выполнить свою каталитическую функцию. В некоторых случаях молекула субстрата также меняет конформацию после связывания в активном центре. В отличие от модели «ключ-замок», модель индуцированного соответстия объясняет не только специфичность ферментов, но и стабилизацию переходного состояния.

Модификации

Многие ферменты после синтеза белковой цепи претерпевают модификации, без которых фермент не проявляет свою активность в полной мере. Такие модификации называются посттрансляционными модификациями (процессингом). Один из самых распространенных типов модификации - присоединение химических групп к боковым остаткам полипептидной цепи. Например, присоединение остатка фосфорной кислоты называется фосфорилированием, оно катализируется ферментом киназой . Многие ферменты эукариот гликозилированы, то есть модифицированы олигомерами углеводной природы.

Еще один распространенный тип посттранляционных модификаций - расщепление полипептидной цепи. Например, химотрипсин (протеаза , участвующая в пищеварении), получается при выщеплении полипептидного участка из химотрипсиногена. Химотрипсиноген является неактивным предшественником химотрипсина и синтезируется в поджелудочной железе . Неактивная форма транспортируется в желудок , где превращается в химотрипсин. Такой механизм необходим для того, чтобы избежать расщепления поджелудочной железы и других тканей до поступления фермента в желудок. Неактивный предшественник фермента называют также «зимогеном».

Кофакторы ферментов

Некоторые ферменты выполняют каталитическую функцию сами по себе, безо всяких дополнительных компонентов. Однако есть ферменты, которым для осуществления катализа необходимы компоненты небелковой природы. Кофакторы могут быть как неорганическими молекулами (ионы металлов, железо-серные кластеры и др.), так и органическими (например,

Ферменты – это особый вид протеинов, которым природой отведена роль катализаторов разных химических процессов.

Этот термин постоянно на слуху, правда, далеко не все понимают, что такое фермент или энзим, какие функции выполняет это вещество, а также чем отличаются ферменты от энзимов и отличаются ли вообще. Все это сейчас и узнаем.

Без этих веществ ни люди, ни животные не смогли бы переваривать пищу. А впервые к применению ферментов в быту человечество прибегло более 5 тысяч лет тому назад, когда наши предки научились хранить молоко в «посуде» из желудков животных. В таких условиях под воздействием сычужного фермента молоко превращалось в сыр. И это только один из примеров работы энзима в качестве катализатора, ускоряющего биологические процессы. Сегодня ферменты незаменимы в промышленности, они важны для производства сахара, маргаринов, йогуртов, пива, кожи, текстиля, спирта и даже бетона. В моющих средствах и стиральных порошках также присутствуют эти полезные вещества – помогают выводить пятна при низких температурах.

История открытия

Энзим в переводе из греческого означает «закваска». А открытию этого вещества человечество обязано голландцу Яну Баптисту Ван-Гельмонту, жившему в XVI веке. В свое время он весьма заинтересовался спиртовым брожением и в ходе исследования нашел неизвестное вещество, ускоряющее этот процесс. Голландец назвал его fermentum, что в переводе означает «брожение». Затем, почти трема веками позже, француз Луи Пастер, также наблюдая за процессами брожения, пришел к выводу, что ферменты – не что иное, как вещества живой клетки. А через некоторое время немец Эдуард Бухнер добыл фермент из дрожжей и определил, что это вещество не является живим организмом. Он также дал ему свое название – «зимаза». Еще несколькими годами позже другой немец Вилли Кюне предложил все белковые катализаторы разделить на две группы: ферменты и энзимы. Причем вторым термином он предложил называть «закваску», действия которой распространяются вне живых организмов. И лишь 1897 год положил конец всем научным спорам: оба термины (энзим и фермент) решено использовать как абсолютные синонимы.

Структура: цепь из тысяч аминокислот

Все ферменты являются белками, но не все белки – ферменты. Как и другие протеины, энзимы состоят из . И что интересно, на создание каждого фермента уходит от ста до миллиона аминокислот, нанизанных, словно жемчуг на нить. Но эта нить не бывает ровной – обычно изогнута в сотни раз. Таким образом, создается трехмерная уникальная для каждого фермента структура. Меж тем, молекула энзима – сравнительно крупное образование, и лишь небольшая часть его структуры, так называемый активный центр, участвует в биохимических реакциях.

Каждая аминокислота соединена с другой определенным типом химической связи, а каждый фермент имеет свою уникальную последовательность аминокислот. Для создания большинства из них используются примерно 20 видов аминовеществ. Даже незначительные изменения последовательности аминокислот могут кардинально менять внешний вид и «таланты» фермента.

Биохимические свойства

Хотя при участии ферментов в природе происходит огромное количество реакций, но все они могут быть разгруппированы на 6 категорий. Соответственно, каждая из этих шести реакций протекает под влиянием определенного типа ферментов.

Реакции при участии энзимов:

Окисление и восстановление.

Ферменты, участвующие в этих реакциях, называются оксидоредуктазами. В качестве примера можно вспомнить как, алкогольдегидрогеназы преобразуют первичные спирты в альдегид.

Реакция переноса группы.

Ферменты, благодаря которым происходят эти реакции, называются трансферазами. Они обладают умением перемещать функциональные группы от одной молекулы к другой. Так происходит, например, когда аланинаминотрансферазы перемещают альфа-аминогруппы между аланином и аспартатом. Также трансферазы перемещают фосфатные группы между АТФ и другими соединениями, а с остатков глюкозы создают дисахариды.

Гидролиз.

Гидролазы, участвующие в реакции, умеют разрывать одинарные связи, добавляя элементы воды.

Создание или удаление двойной связи.

Этот вид реакций негидролитическим путем происходит при участии лиазы.

Изомеризация функциональных групп.

Во многих химических реакциях положение функциональной группы изменяется в пределах молекулы, но сама молекула состоит из того же количества и типов атомов, что были до начала реакции. Иными словами, субстрат и продукт реакции являются изомерами. Такого типа трансформации возможны под влиянием ферментов изомеразы.

Образование одинарной связи с устранением элемента воды.

Гидролазы разрушают связь, добавляя в молекулу элементы воды. Лиазы осуществляют обратную реакцию, удаляя водную часть из функциональных групп. Таким образом, создают простую связь.

Как работают в организме

Ферменты ускоряют практически все химические реакции, происходящие в клетках. Они имеют жизненноважное значение для человека, облегчают пищеварение и ускоряют метаболизм.

Некоторые из этих веществ помогают разрушать слишком большие молекулы на более мелкие «куски», которые организм сможет переварить. Другие наоборот связывают мелкие молекулы. Но ферменты, говоря научным языком, обладают высокой селективностью. Это значит, что каждое из этих веществ способно ускорять только определенную реакцию. Молекулы, с которыми «работают» ферменты, называются субстратами. Субстраты в свою очередь создают связь с частью фермента, именуемой активным центром.

Существуют два принципа, объясняющие специфику взаимодействия ферментов и субстратов. В так называемой модели «ключ-замок» активный центр фермента занимает в субстрате место строго определенной конфигурации. Согласно другой модели, оба участника реакции, активный центр и субстрат, меняют свои формы, чтобы соединиться.

По какому бы принципу ни происходило взаимодействие результат всегда одинаковый – реакция под воздействием энзима протекает во много раз быстрее. Вследствие такого взаимодействия «рождаются» новые молекулы, которые потом отделяются от фермента. А вещество-катализатор продолжает выполнять свою работу, но уже при участии других частиц.

Гипер- и гипоактивность

Бывают случаи, когда энзимы выполняют свои функции с неправильной интенсивностью. Чрезмерная активность вызывает чрезмерное формирование продукта реакции и дефицит субстрата. В результате – ухудшение самочувствия и серьезные болезни. Причиной гиперактивности энзима может быть как генетическое нарушение, так и избыток витаминов или , используемых в реакции.

Гипоактивность ферментов может даже стать причиной смерти, когда, например, энзимы не выводят из организма токсины либо возникает дефицит АТФ. Причиной такого состояния также могут быть мутированные гены или, наоборот, гиповитаминоз и дефицит других питательных веществ. Кроме того, пониженная температура тела аналогично замедляет функционирование энзимов.

Катализатор и не только

Сегодня можно часто услышать о пользе ферментов. Но что такое эти вещества, от которых зависит работоспособность нашего организма?

Энзимы – это биологические молекулы, жизненный цикл которых не определяется рамками от рождения и смерти. Они просто работают в организме до тех пор, пока не растворятся. Как правило, это происходит под воздействием других ферментов.

В процессе биохимической реакции они не становятся частью конечного продукта. Когда реакция завершена, фермент покидает субстрат. После этого вещество готово снова приступить к работе, но уже на другой молекуле. И так продолжается столько, сколько необходимо организму.

Уникальность ферментов в том, что каждый из них выполняет только одну, ему отведенную функцию. Биологическая реакция происходит только тогда, когда фермент находит правильный для него субстрат. Это взаимодействие можно сравнить с принципом работы ключа и замка – только правильно подобранные элементы смогут «сработаться». Еще одна особенность: они могут работать при низких температурах и умеренном рН, а в роли катализаторов являются более стабильными, чем любые другие химические вещества.

Ферменты в качестве катализаторов ускоряют процессы метаболизма и другие реакции.

Как правило, эти процессы состоят из определенных этапов, каждый из которых требует работы определенного энзима. Без этого цикл преобразования или ускорения не сможет завершиться.

Пожалуй, из всех функций ферментов наиболее известна – роль катализатора. Это значит, что энзимы комбинируют химические реагенты таким образом, чтоб снизить энергетические затраты, необходимые для более быстрого формирования продукта. Без этих веществ химические реакции протекали бы в сотни раз медленнее. Но на этом способности энзимов не исчерпываются. Все живые организмы содержат энергию, необходимую им для продолжения жизни. Аденозинтрифосфат, или АТФ, это своего рода заряженная батарейка, которая снабжает клетки энергией. Но функционирование АТФ невозможно без ферментов. И главный энзим, производящий АТФ, – синтаза. Для каждой молекулы глюкозы, которая трансформируется в энергию, синтаза производит около 32-34 молекул АТФ.

Помимо этого, энзимы (липаза, амилаза, протеаза) активно применяются в медицине. В частности, служат компонентом ферментативных препаратов, таких как «Фестал», «Мезим», «Панзинорм», «Панкреатин», применяемых для лечения несварения желудка. Но некоторые энзимы способны также влиять на кровеносную систему (растворяют тромбы), ускорять заживление гнойных ран. И даже в противораковой терапии также прибегают к помощи ферментов.

Факторы, определяющие активность энзимов

Поскольку энзим способен ускорять реакции во много раз, его активность определяется так называемым числом оборотов. Этот термин обозначает количество молекул субстрата (реагирующего вещества), которую способна трансформировать 1 молекула фермента за 1 минуту. Однако существует ряд факторов, определяющих скорость реакции:

Концентрация субстрата.

Увеличение концентрации субстрата ведет к ускорению реакции. Чем больше молекул действующего вещества, тем быстрее протекает реакция, поскольку задействовано больше активных центров. Однако ускорения возможно только до тех пор, пока не задействуются все молекулы фермента. После этого, даже повышение концентрации субстрата не приведет к ускорению реакции.

Температура.

Обычно повышение температуры ведет к ускорению реакций. Это правило работает для большинства ферментативных реакций, но только до тех пор, пока температура не поднимется выше 40 градусов по Цельсию. После этой отметки скорость реакции, наоборот, начинает резко снижаться. Если температура опустится ниже критической отметки, скорость ферментативных реакций повысится снова. Если температура продолжает расти, ковалентные связи рушатся, а каталическая активность фермента теряется навсегда.

Кислотность.

На скорость ферментативных реакций также влияет показатель рН. Для каждого фермента существует свой оптимальный уровень кислотности, при котором реакция проходит наиболее адекватно. Изменение уровня рН сказывается на активности фермента, а значит, и скорости реакции. Если изменения слишком велики, субстрат теряет способность связываться с активным ядром, а энзим больше не может катализировать реакцию. С восстановлением необходимого уровня рН, активность фермента также восстанавливается.

Ферменты, присутствующие в человеческом организме, можно разделить на 2 группы:

метаболические;
пищеварительные.

Метаболические «работают» над нейтрализацией токсических веществ, а также способствуют выработке энергии и белков. Ну и, конечно, ускоряют биохимические процессы в организме.

За что отвечают пищеварительные – понятно с названия. Но и здесь срабатывает принцип селективности: определенный тип ферментов влияет только на один вид пищи. Поэтому для улучшения пищеварения можно прибегнуть к маленькой хитрости. Если организм плохо переваривает что-то из еды, значит надо дополнить рацион продуктом, содержащим фермент, который способен расщепить трудно перевариваемую пищу.

Пищевые ферменты – катализаторы, которые расщепляют продукты питания до состояния, в котором организм способен поглощать из них полезные вещества. Пищеварительные энзимы бывают нескольких типов. В человеческом организме разные виды ферментов содержатся на разных участках пищеварительного тракта.

Ротовая полость

На этом этапе на пищу воздействует альфа-амилаза. Она расщепляет углеводы, крахмалы и глюкозу, которые содержатся в картофеле, фруктах, овощах и других продуктах питания.

Желудок

Здесь пепсин расщепляет белки до состояния пептидов, а желатиназа – желатин и коллаген, содержащиеся в мясе.

Поджелудочная железа

На этом этапе «работают»:

трипсин – отвечает за расщепление белков;
альфа-химотрипсин – помогает усвоению протеинов;
эластазы – расщепляют некоторые виды белков;
нуклеазы – помогают расщеплять нуклеиновые кислоты;
стеапсин – способствует усвоению жирной пищи;
амилаза – отвечает за усвоение крахмалов;
липаза – расщепляет жиры (липиды), содержащиеся в молочных продуктах, орехах, маслах и мясе.

Тонкая кишка

Над пищевыми частицами «колдуют»:

пептидазы – расщепляют пептидные соединения к уровню аминокислот;
сахараза – помогает усваивать сложные сахара и крахмалы;
мальтаза – расщепляет дисахариды к состоянию моносахаридов (солодовый сахар);
лактаза – расщепляет лактозу (глюкозу, содержащуюся в молочных продуктах);
липаза – способствует усвоению триглицеридов, жирных кислот;
эрепсин – воздействует на протеины;
изомальтаза – «работает» с мальтозой и изомальтозой.

Толстый кишечник

Здесь функции ферментов выполняют:

кишечная палочка – отвечает за переваривание лактозы;
лактобактерии – влияют на лактозу и некоторые другие углеводы.

Кроме названных энзимов, существуют еще:

диастаза – переваривает растительный крахмал;
инвертаза – расщепляет сахарозу (столовый сахар);
глюкоамилаза – превращает крахмал в глюкозу;
альфа-галактозидаза – способствует перевариванию бобов, семян, соевых продуктов, корневых овощей и листовых;
бромелайн – фермент, полученный из , способствует расщеплению разных видов белков, эффективен при разных уровнях кислотности среды, обладает противовоспалительными свойствами;
папаин – фермент, выделенный из сырой папайи, способствует расщеплению мелких и крупных протеинов, эффективен в широком диапазоне субстратов и кислотности.
целлюлаза – расщепляет целлюлозу, растительные волокна (в человеческом организме не обнаружена);
эндопротеаза – расщепляет пептидные связи;
экстракт бычьей желчи – энзим животного происхождения, стимулирует моторику кишечника;
ксиланаза – расщепляет глюкозу из зерновых.

Катализаторы в продуктах

Ферменты имеют решающее значение для здоровья, поскольку помогают организму расщеплять пищевые компоненты до состояния, пригодного для использования питательных веществ. Кишечник и поджелудочная железа производят широкий спектр ферментов. Но кроме этого, многие их полезных веществ, способствующих пищеварению, содержатся также и в некоторых продуктах.

Ферментированные продукты являются практически идеальным источником полезных бактерий, необходимых для правильного пищеварения. И в то время, когда аптечные пробиотики «работают» только в верхнем отделе пищеварительной системы и часто не добираются до кишечника, эффект от ферментативных продуктов ощущается во всем желудочно-кишечном тракте.

Например, абрикосы содержат в себе смесь полезных энзимов, в том числе инвертазу, которая отвечает за расщепление глюкозы и способствует быстрому высвобождению энергии.

Натуральным источником липазы (способствует более быстрому перевариванию липидов) может послужить авокадо. В организме это вещество производит поджелудочная железа. Но дабы облегчить жизнь этому органу, можно побаловать себя, например, салатом с авокадо – вкусно и полезно.

Кроме того, что банан, пожалуй, самый известный источник калия, он также поставляет в организм амилазу и мальтазу. Амилаза содержится также в хлебе, картофеле, крупах. Мальтаза способствует расщеплению мальтозы, так называемого солодового сахара, который в обилии представлен в пиве и кукурузном сиропе.

Другой экзотический фрукт – ананас содержит в себе целый набор энзимов, в том числе и бромелайн. А он, согласно некоторым исследованиям, еще и обладает противораковыми и противовоспалительными свойствами.

Экстремофилы и промышленность

Экстремофилы – это вещества, способны сохранять жизнедеятельность в экстремальных условиях.

Живые организмы, а также ферменты, позволяющие им функционировать, были найдены в гейзерах, где температура близка к точке кипения, и глубоко во льдах, а также в условиях крайней солености (Долина Смерти в США). Кроме того, ученые находили энзимы, для которых уровень рН, как оказалось, также не принципиальное требование для эффективной работы. Исследователи с особым интересом изучают ферменты-экстремофилы, как вещества, которые могут быть широко использованы в промышленности. Хотя и сегодня энзимы уже нашли свое применение в индустрии как биологически и экологически чистые вещества. К применению энзимов прибегают в пищевой промышленности, косметологии, производстве бытовой химии.

Более того, «услуги» ферментов в таких случаях обходятся дешевле, чем синтетических аналогов. Кроме того, натуральные вещества являются биоразлагаемыми, что делает их использование безопасным для экологии. В природе существуют микроорганизмы, способные расщепить ферменты на отдельные аминокислоты, которые затем становятся компонентами новой биологической цепочки. Но это, как говорится, уже совсем другая история.

Прежде чем обсуждать свойства ферментов и зависимость ферментов от каких-либо факторов необходимо определиться с понятием активность ферментов .

В повседневной биохимической практике практически не оценивается количество фермента, а только его активность . Активность – более широкое понятие, чем количество. Она подразумевает в первую очередь результат реакции , а именно убыль субстрата или накопление продукта. Естественно, при этом нельзя игнорировать время , которое проработал фермент и число молекул фермента. Но так как число молекул фермента подсчитать обычно нереально, то используют количество биологического материала, содержащего фермент (объем или массу).

Таким образом при определении активности ферментов нужно одновременно учитывать три переменные :

масса полученного продукта или исчезнувшего субстрата,
время , потраченное на реакцию,
количество фермента , но на самом деле массу или объем биологического материала, содержащего фермент.

Для понимания соотношений указанных факторов наглядным и простым примером может служить строительство двух зданий. Здания приравняем к продукту реакции, рабочие – это ферменты, бригада пусть соответствует объему биологического материала. Итак, задачи из 3-го класса:

1. На постройке одного здания трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада из 5 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?

2. На постройке одного здания из 3 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого здания из 12 этажей – бригада тоже из 10 человек. Строительство закончено одновременно и в полном объеме. Где выше активность рабочих?

3. На постройке одного здания из 5 этажей трудилась бригада из 10 человек, другого такого же здания – бригада тоже из 10 человек. Строительство первого здания заняло 20 дней, второе построено за 10 дней. Где выше активность рабочих?

Основы количественного определения активности ферментов

1. Активность фермента выражается в скорости накопления продукта или скорости убыли субстрата в пересчете на количество материала , содержащего фермент.

В практике обычно используют:

единицы количества вещества – моль (и его производные ммоль, мкмоль), грамм (кг, мг),
единицы времени – минута, час, секунда,
единицы массы или объема – грамм (кг, мг), литр (мл).

Активно используются и другие производные – катал (моль/с), международная единица активности (МЕ, Unit) соответствует мкмоль/мин.

Таким образом, активность фермента может выражаться, например, в ммоль/с×л, г/час×л, МЕ/л, кат/мл и т.д.

Например, известно,

что 1 г пепсина расщепляет 50 кг яичного белка за один час – таким образом, его активность составит 50 кг/час на 1 г фермента,
если 1,6 мл слюны расщепляет 175 кг крахмала в час – активность амилазы слюны составит 109,4 кг крахмала в час на 1 мл слюны или 1,82 кг/мин×г или 30,3 г крахмала/ с×мл.

2. Создание стандартных условий , чтобы можно было сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях – оптимальная рН и фиксированная температура , например, 25°С или 37°С, соблюдение времени инкубации субстрата с ферментом.

1. Особенности ферментативных реакций

2. Влияние температуры на активность ферментов

3. Влияние рН на активность ферментов

4. Активаторы и ингибиторы ферментов

I . Все ферментативные реакции имеют 4 особенности

· Высокая активность ферментов;

· Обратимость действия ферментов;

· Специфичность действия ферментов;

· Лабильность (чувствительность).

Высокая активность ферментов. Ферменты обуславливают высокую скорость ферментативной реакции, которая характеризуется числом оборотов ферментов – это количество молекул субстрата, которое превращается в продукты реакции при действии одной молекулы фермента в единицу времени. Например, алкогольдегидрогеназа имеет активность 4700 ед., фосфорилаза – 50000 ед., a-амилаза – 16000 ед.

Обратимость действия ферментов установил Данилевский. Под обратимостью действия ферментов понимают образование комплекса ES и его распад, т.е. реакции с участием фермента могут идти как в одну сторону (биосинтез), так и в обратную (распад).

Специфичность действия ферментов - каждый фермент действует только на свой определенный субстрат или группу родственных субстратов. Например, инвертаза действует на сахарозу; a-амилаза – только на крахмал и декстрины; протеазы – на белки.

Существует две тачки зрения, объясняющие специфичность действия ферментов. По образному представлению Э. Фишера “фермент подходит к субстрату как ключ к замку”, т.е. топография активного центра фермента не только высокоупорядочена, но и жестко закреплена. Активной центр фермента соответствует топографии только одного единственного субстрата. Вторая точка зрения, предложена Д. Кошландом - теория индуцированного соответствия фермента и субстрата: конформация фермента, в особенности его активного центра, способна к определенным модификациям. В зависимости от конформационной подвижности активного центра фермент способен взаимодействовать либо с немногими, либо с самыми разными субстратами. Иными словами, в момент образования комплекса ЕS, происходят изменения в структуре как фермента, так и субстрата. В результате чего они адаптируются друг к другу.

Специфичность ферментов играет важную роль в процессе обмена веществ в живом организме. (Если бы фермент не имел уникальных свойств, то в живом организме не было бы обмена веществ)

По признаку специфичности ферменты делятся на 2 группы:

· Абсолютная специфичность – фермент действует только на одно-единственное вещество или катализирует только определенное превращение этого вещества;

· Относительная или групповая специфичность – ферменты действуют сразу на многие субстраты, обладающих рядом общих структурных свойств.

Лабильность (чувствительность) – все ферменты чувствительны к повышению температуры и низким значениям рН, при которых происходит потеря активности ферментов.

II . Важнейшим фактором, от которого зависит активность ферментов, является температура.

Графически зависимость скорости ферментативной реакции от температуры выглядит следующим образом:

При 0°С, а тем более при температурах ниже 0°С действие большинства ферментов прекращается. Повышение температуры (кривая 1) выше 0°С способствует увеличению активности ферментов (увеличивается число столкновений реагирующих веществ). При определенной температуре фермент проявляет максимальную активность. Для большинства ферментов оптимальной температурой действия является 40-50°С. Дальнейшее увеличение температуры приводит к инактивации ферментов (уменьшения активности) вследствие термической денатурации белковой молекулы (кривая 2).

Изменение скорости реакции при повышении температуры на каждые 10°С выражают температурным коэффициентом Q 10 . Температурный коэффициент представляет собой отношение скорость реакции при данной температуре v t +10 к скорости реакции при температуре на 10°С ниже данной:

Величина Q 10 для химических реакций лежит в приделах 2-4, для ферментативной реакции – между 1 и 2; Q 10 ферментативных реакции заметно снижается при повышении температуры.

III . Каждый фермент проявляет своё действие в пределах довольно узкой зоны рН. Графическая зависимость активности фермента от рН имеет вид:

В кислой среде, при низких значениях рН, имеет форму ЕН 2 + , в такой форме он малоактивен. При оптимуме рН фермент обладает максимальной активностью и находится в форме ЕН; при подщелачивании среды, фермент приобретает форму Е - .

Оптимальной активности соответствует определенная область рН, причем каждый фермент имеет свое оптимальное значение рН действия (например, бактериальная a-ами-лаза имеет рН оптимум при 6, а a-амилаза микроскопических грибов – 4,7). Оптимальное значение рН связано с аминокислотным составом ферментов.

Колоколообразная форма кривой объяснится с амфотерной природой ферментов; восходящая и нисходящая ветви этой кривой являются типичными кривыми титрования и определяется значениями рК ионных групп, которые находятся в активном центре ферментов.

Для определения функциональных групп, входящих в активный центр фермента, необходимо определить зависимости активности этого фермента от рН при разных температурах и определить значение рК. Зная значения ΔрК для кислой и щелочной ветви зависимости v = f(pH) находят функциональные группы, которые соответствуют этому значению.

IV . Все вещества, сопровождающие фермент в процессе реакции можно подразделит на активаторы, ингибиторы и нейтральные соединения.

Активаторы – химические соединения, повышающие действие ферментов (например, глютатион активизирует действие протеаз, NaCl увеличивает активность амилаз); ингибиторы – соединения, подавляющие их активность (например, группа –CN подавляет активность дыхательных ферментов, находящихся в цитохромной системе) и нейтральные соединения не оказывают никакого влияния на ферменты.

Процесс ингибирования может быть обратимым и необратимым.

Обратимые ингибиторы бывают:

· Конкурентного действия – ингибитор взаимодействует с функциональными группами активного центра ферментов. Ингибирование в данном случае зависит от концентрации субстрата: если [S] велика, то влияние ингибитора [I] может не проявляться; если же [S] мала, то ингибитор может вытеснить субстрат из соединения с ферментом, действие которого при этом затормаживается. Тройной комплекс ЕSI при конкурентном ингибировании никогда не образуется.

· Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, когда ингибитор не способен присоединяться к ферменту, не он может связываться с фермент-субстратным комплексом, переводя его в неактивную форму.

· При смешанном ингибировании ингибитор действует как на участок связывания ES, так и на каталитический центр фермента.

Исследования по определению ферментативной активности МКД на основе различных бактерий проводились в четыре этапа. Для исследования были отобраны образцы МКД на основе монокультур МКД-В {Bifidobacter bifidum longum), МКД-S (Streptococcus termophilus ), МКД-P (Propionobacterium acidi-propionicum), МКД-L {Lactobacillus acidophilus).

Цель исследований - определение способности у пробиотических микроорганизмов, входящих в состав МКД, синтезировать ферменты.

На первом этапе по ГОСТ 20264.4-89 «Препараты ферментные. Метод определения амилолитической активности» во всех образцах МКД методом Айсона определялась суммарная амилолитическая активность. Метод Ансона основан на гидролизе крахмала ферментно-амилолитическим комплексом до декстринов различной молекулярной массы.

На втором этапе по ГОСТ 20264.2-88 «Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности» определялась суммарная протеолитическая активность (ПА) в исследуемых образцах. Метод основан на гидролизе белка казеината натрия ферментным комплексом при pH-7,2. Для определения ПА нейтральной протеазы 0-10 ед/мл проверены минимальные разведения. Кислая протеаза определялась при pH-5,5, при которой проходит гидролиз белка.

На третьем этапе по ТУ9291-008-13684916-05 во всех представленных образцах МКД определялась общая целлюлозолитическая активность (ЦА). Методика определения целлюлазы основана на определении восстанавливающих сахаров в результате гидролиза целлюлазы хроматографической бумаги под действием фермента. Метод рекомендован международной комиссией ИЮПАК по биотехнологии в качестве основного теста на целлюлазную активность. За единицу эффективности целлюлазы принимают такое количество фермента, которое при действии на хроматографическую бумагу при 50°С и pH 4,8 образует 1 ммоль восстанавливающих сахаров в 1 мин. Как правило, активность выражается в единицах на миллилитр.

Последним, четвертым, этапом было определение активности липазы (ЛА). Метод определения липазы по методике Скермана основан на титровании щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы, при использовании в качестве субстрата оливкового масла. При определении липазы использовалась реакционная смесь, состоящая из 6,5 мл 1/15 М фосфатно-цитрат- ного буфера, 2,5 мл эмульсии оливкового масла в 1 %-м растворе поливинилового спирта в соотношении 2:3 и 1 мл фильтрата культуральной жидкости.

Исследования МКД на основе различных микроорганизмов-пробиотиков показали, что все исследуемые МКД содержат одну или несколько групп ферментов (табл. 8). Так, МКД-В показала наличие всех исследуемых групп ферментов. МКД-Р содержит в своем составе три группы ферментов: амилолитические, протеолитические, целлюлозолитические. В МКД-L обнаружены также три группы ферментов: протеолитические, целлюлозолитические и липолитические, слабо выражена амилолитическая группа. МКД-S имеет в своем составе две группы ферментов: протеолитическую и целлюлозолитическую, амилолитическая и липолитическая активность выражены слабо.

Таблица 8

Ферментативная активность МКД, ед/мл

Анализируя данные, полученные в результате исследования ферментативной активности МКД, можно отметить, что все исследуемые МКД имеют высокую степень активности целлюлазы - от 64,46 (МКД-Р) до 72,4 ед/мл (МКД-L).

МКД-S и МКД-В имеют одинаковую активность целлюлазы - 66,7 ед/мл.

Все исследуемые нами МКД содержат кислую протеазу, в которой гидролиз белка осуществляется при pH-5,5. Наибольшая активность протеазы обнаружена в МКД-Р - 7,5 ед/мл, наименьшая - в МКД-L (1,0 ед/мл). МКД-В имеет значение активности протеазы 2,0, МКД-S - 2,5 ед/мл.

Активность липазы определена в МКД-L - 1,4 и в МКД-В - 12,6 ед/мл. В МКД-S и МКД-Р фермент липаза не обнаружен.

Амилолитическая активность обнаружена в МКД-В - 11,2 и в МКД-Р - 9,4 ед/мл.

На рис. 1^1 графически представлены значения ферментативной активности МКД.

Рис. 1.

Рис. 2.

Рис. 3.

Рис. 4.

Результаты исследования ферментативной активности МКД на основе различных бактерий согласуются с литературными данными о том, что бактерии-пробион- ты обладают ферментативной активностью. Наши исследования выявили лидирующие ферментные свойства бифидобактерий в составе МКД по сравнению с другими исследуемыми микроорганизмами. Различные штаммы бифидобактерий составляют, по некоторым данным, до 90 % представителей нормофлоры кишечника птицы. Бифидобактерии находятся во всех отделах кишечника.

Синтезируемые ими ферментные группы участвуют во всех ферментных процессах при превращению питательных веществ корма в желудочно-кишечном тракте. По мнению А. И. Хавкина (2003), бифидобактерии принимают активное участие в процессах энзиматического пререваривания кормов, усиливая гидролиз протеинов, сбраживают углеводы, омыляют жиры, растворяют клетчатку Все исследуемые нами бактерии в составе МКД показали определенную степень ферментативной активности. Полученные данные свидетельствуют о специфичности уровня и спектра производимых ферментных групп в зависимости от принадлежности микроорганизмов к определенным видам и условиям жизнедеятельности. Эти данные, в совокупности с остальными характеристиками, должны учитываться при разработке различных рекомендаций по применению тех или иных видов пробиотических кормовых добавок.